Мікроскопія та інструментальні методи в біології 07 2024
Цей курс розглядає сучасні методи візуалізації, вивчення структури та взаємодій біологічних молекул. Його основна мета - розповісти студентам про можливості та обмеження кожного з найпопулярніших методів і пояснити, як обрати найпростіший та найефективніший підхід для відповіді на конкретне експериментальне питання.
Курс складається з кількох блоків, які будуть викладатися спеціалістами у відповідних галузях: Флуоресцентна спектроскопія (Василь Пивоваренко, КНУ); Флуоресцентна мікроскопія (Юрій Ковальчук, Університет Тюбінгена; Петро Хороший IOCB Prague); Електронна мікроскопія (Ніна Бондаренко, Вища медична школа Гановера/ДНУ); LC-MS та основи протеоміки (Олег Лущак, ПНУ/LMS London); Допоміжні методи встановлення структури (Володимир Швадчак, ПНУ)
Практичні роботи охоплюватимуть робочий процес обробки реальних експериментальних наборів даних з флуоресцентних та CD експериментів, планування хроматографічних експериментів, поглиблену роботу з зображеннями флуоресцентної мікроскопії за допомогою ImageJ.
Курс складається з 26 лекційних та 14 семінарських/практичних занять. Лекції та семінари цього курсу триватимуть по півтори години. Для семінарських занять студенти будуть поділені на 2 групи.
Всі заняття проводитимуться українською мовою.
Поглинання світла. Колір. Спектрофотометри. Абсорбційні методи. Дипольний момент молекул і довжина хвилі поглинання.
Принципи флуоресценції. Діаграма Яблонського. Квантовий вихід флуоресценції. Флуорофори. Триптофан та інші природні флуорофори. Сольватохромізм.
Поляризоване світло. Анізотропія флуоресценції. Зупинений потік (Stopped flow)
Класична мікроскопія, фазовий контраст. Флуоресцентна мікроскопія. Принципові схеми мікроскопів. Лазери. Фільтри. Дихроїчні дзеркала. Канали. Цифрові зображення. Роздільна здатність зображення, мікрони та пікселі.
Мічення білків. Cys-, Lys-реактивні барвники. Інтеркалюючі барвники. FRET та його застосування для вивчення взаємодій білків.
Конфокальна мікроскопія. Z-зрізи. TIRF. FRET і виявлення взаємодій в мікроскопії. Час життя флуоресценції та FLIM. Дифракційна межа. Надвисока роздільна здатність, STORM. PALM. Двофотонна мікроскопія.
Як побудувати або налаштувати мікроскоп?
ImageJ/Fiji. Колокалізація.
Флуоресцентні білки. Малі синтетичні барвники. Вибір флуорофорів для усунення завад на каналах. Мембранні трекери, фарбування ядер. Фотодеградація під час вимірювань. FRAP. Інтенсивність світла і пошкодження клітин. Контрольоване фотовивільнення. Молекули для фотозшивання.
CD-спектроскопія для визначення структури білків. ІЧ-спектроскопія.
Електрофорез білків та олігонуклеотидів. Аналітичне ультрацентрифугування. Динамічне світлорозсіювання (DLS). Кореляція флуоресценції (FCS, FCCS).
Спін. 13С і 15N мічення білків. Ядерний магнітний резонанс (ЯМР) для аналізу структури білків. Твердотільний ЯМР. МРТ-візуалізація. Електронний парамагнітний резонанс (ЕПР) та вільні радикали.
Принципи. Методи кристалізації білків. SAXS.
Принцип, препаративна та аналітична хроматографія. ВЕРХ (HPLC) Типи колонок. Іонообмінна хроматографія. Розділення за розміром.
Мас-спектрометрія. LC-MS. ESI, MALDI та інші іонізаційні методи. Типи детекторів. Фрагментація.
Що це таке? Пробопідготовка.
Імуногістохімія, проточна цитофлуориметрія, гібридизація in situ. Вестерн-блотинг, ІФА, двовимірний гель-електрофорез.
Секвенування першого покоління, секвенування другого або наступного покоління, секвенування третього покоління. цифрова ПЛР, рідинна біопсія.
Принцип. Роздільна здатність. Режими. Підготовка зразків.
Принцип дії та схема мікроскопів. Роздільна здатність по осях XY та Z. Підготовка зразків. Швидкість сканування та пошкодження зразків. Застосування для підрахунку кількості доменів білків.
Методи високопродуктивного скринінгу (HTS) та розробка методологій.
Фотоперемикачі, фотовивільнення. Обговорення STED, STORM, TIRF, FLIM, колокалізації
- Peter Jomo Walla Modern Biophysical Chemistry Detection and Analysis of Biomolecules, Wiley-VCH 2014 // розділи 1,2
- Пивоваренко В.Г. Абсорбційна та флуоресцентна спектроскопія органічних сполук; К.: ВПЦ «Київський університет», 2023 (препрінт викладений автором на ФБ)
- Каталог спектрів поглинання та флуоресценції барвників
- Lakowicz Principles of fluorescence spectroscopy
- Demchenko Introduction to Fluorescence Sensing https://doi.org/10.1007/978-3-030-60155-3
- Dagmar Klostermeier, Markus G. Rudolph Biophysical Chemistry CRC Press 2017 (SBN 9781482252255) // розділи 19, 23.1
- Завантаження безкоштовної програми для обробки зображень Fiji https://fiji.sc/ (це практично стандарт в флуоресцентній мфікроскопії)
- Peter Bankhead. Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ, 2014 (підручник по роботі в Fiji/ImageJ)
- https://www.ibiology.org/techniques/bioimage-analysis/ (лекції по обробці зображень)
- https://www.ibiology.org/online-biology-courses/microscopy-series/fluorescence-microscopy/
- https://www.microscopyu.com/techniques/confocal
- https://www.olympus-lifescience.com/en/resources/
- Tam, J. and Merino, D. (2015), Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods. J. Neurochem., 135: 643-658. https://doi.org/10.1111/jnc.13257
- Schermelleh, L., Ferrand, A., Huser, T. et al. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol 21, 72–84 (2019). https://doi.org/10.1038/s41556-018-0251-8
