Мікроскопія та інструментальні методи в біології 2025
Цей курс розглядає сучасні методи візуалізації, вивчення структури та взаємодій біологічних молекул. Його основна мета - розповісти студентам про можливості та обмеження кожного з найпопулярніших методів і пояснити, як обрати найпростіший та найефективніший підхід для відповіді на конкретне експериментальне питання.
Він складається з кількох блоків, які будуть викладатися спеціалістами у відповідних галузях:
Флуоресцентна спектроскопія (Володимир Швадчак, ПНУ);
Флуоресцентна мікроскопія (Юрій Ковальчук, Університет Тюбінгена; Петро Хороший IOCB Prague);
Робота з культурами клітин (Максим Галкін, Інститут раку, Данія);
LC-MS та основи протеоміки (Олег Лущак, ПНУ/LMS London);
Молекулярна діагностика (Ніна Бондаренко, ДДМУ)
Електронна мікроскопія (Ніна Бондаренко, ДДМУ);
Допоміжні методи встановлення структури (Володимир Швадчак, ПНУ)
Лекції буде доповнено практичними заняттями на яких учасники курсу зможуть самостійно проробити повний процес аналізу реальних експериментальних наборів даних з експериментів з флуоресценції, кругового дихроїзму, 3D конфокальної мікроскопії, а також обговорити з викладачами переваги й недоліки методів та сфери їх застосування. Крім того на практичних заняттях буде придилено увагу допоміжним розрахунковим навикам потрібним для роботи в галузі.
Для зручності навчання онлайн лекції та практичні зроблено дещо коротшими ніж звичайно прийнято - по півтори академічні години.
Всі заняття проводитимуться українською мовою.
Електромагнітні хвилі. Довжина хвилі, колір. Поглинання, розсіювання, заломлення світла. Дипольний момент молекул і довжина хвилі поглинання. Спектрофотометри. Природні хромофори. Абсорбційні методи.
Принципи флуоресценції. Діаграма Яблонського. Квантовий вихід флуоресценції. Флуорофори. Яскравість. Сольватохромізм.
Триптофан та інші натуральні флуорофори. Cys-, Lys-реактивні барвники. Інтеркалюючі барвники. GFP. Таги. Клік реакції. Введення ненатуральних амінокислот
FRET, час життя збудженого стану. Анізотропія флуоресценції
Робота з великою кількістю зразків (HTS). Розробка методів.
► Домашнє завдання: Робота з даними зі зчитувача плашок (plate reader): визначення IC50 інгібітора на основі кінетичних даних
Трансмісійна мікроскопія, фазовий контраст. Флуоресцентна мікроскопія. Принципові схеми мікроскопів. Лазери. Фільтри. Дихроїчні дзеркала. Канали. Цифрові зображення. Роздільна здатність зображення, мікрони та пікселі. Конфокальна мікроскопія. Z-зрізи.
Колокалізація. FRET для виявлення взаємодій в мікроскопії. FLIM. TIRF. Дифракційна межа. Надвисока роздільна здатність, STORM. PALM. Двофотонна мікроскопія. FRAP.
Як зібрати чи модифікувати сучасний флуоресцентний мікроскоп?
Основи роботи з лініями клітин еукаріотів. Найпоширеніші клітинні лінії. Пасажі. Трансфекція.
Введення флуоресцентних білків. Низькомолекулярні барвники. Перехресні завади каналів (Channel crosstalk) та підбір флуорофорів. Мембранні трекери, фарбування ядер. Фотодеградація під час вимірювань. Інтенсивність світла і пошкодження клітин.
Робота в ImageJ/Fiji з 2D та 3D даними. Стеки, канали, зрізи. ► Домашнє завдання: обробка зображень
Електрофорез білків та олігонуклеотидів. Аналітичне ультрацентрифугування. DLS. FCS. FCCS.
Поляризоване світло. CD-спектроскопія для визначення структури білків. ІЧ-спектроскопія білків.
Спін. 13С та 15N мічення білків. ЯМР для аналізу структури білків. Твердотільний ЯМР. МРТ-візуалізація. ЕПР та вільні радикали.
Принципи рентгеноструктурного аналізу.Кристалізація білка. SAXS.
Основи статистики та похибки. Лінійна та нелінійна регресія. Візуалізація даних.
Принцип та схема мікроскопів. Роздільна здатність по осях XY та Z. Підготовка зразків. Швидкість сканування та пошкодження зразків. Застосування для вивчення доменів білків.
Принцип методу. Стаціонарний режим. Кінетика асоціації та дисоціації.
ВЕРХ (HPLC), препаративні та аналітичні застосування. Типи колонок. Іонообмінна хроматографія. Розділення за розміром (SEC).
Мас-спектрометрія. ESI, MALDI та інші іонізаційні методи. Типи мас-детекторів. Фрагментація. Комбінація рідинної хроматографії та мас-спектрометрії.
Застосування в біологічних дослідженнях
Що це таке? Підготовка зразків.
Імуноцитохімія/імуногістохімія, проточна цитометрія, гібридизація in situ.
ПЛР, мікрочипи, вестерн-блотинг, ІФА, двовимірний гель-електрофорез, мас-спектрометрія.
Cеквенування першого покоління, секвенування другого або наступного покоління, секвенування третього покоління, цифрова ПЛР, рідинна біопсія.
27. Електронна мікроскопія. Принцип. Роздільна здатність. Режими. Підготовка зразків.
Приготування розчинів. Kd, pH, буфери.
► Домашнє завдання: Набір задач для тренування простих розрахунків.
Віртуальна лабораторна робота «Інгібування ферментативної реакції».
Як визначити що саме потрібно виміряти чи щоб дізнатис потрібну інформацію?
Як з набору спектрів порахувати супінь зв'язування та константу взаємодії.
► Домашнє завдання: Розрахунок афінності білка до мембрани на основі зміни емісії триптофану.
► Домашнє завдання: прикладні задачі на CD та SDS-PAGE.
Як читати експериментальну частину в сучасних статтях і аналізувати чому автори обрали саме такий метод.
Загальнодоступні бази даних структур біомолекул. PDB. CIF. Візуалізація структури в програмі VMD.
► Домашнє завдання: аналіз відстаней між залишками в білку на основі структури PDB.
Підсумковий семінар на якому обговорюватимуться плюси й мінуси методів вивчених під час курсу.
